7 发光细菌急性毒性试验程序

7.1 暴露条件

发光细菌急性毒性试验程序暴露条件为：

——室温20℃～25℃，试验过程中温度波动在±1℃范围内；

——持续时间：15 min。

7.2 试验溶液的配制

复苏稀释液（0.85％氯化钠溶液）：取0.85g分析纯氯化钠，用三级水溶解并转移到100mL容量瓶中，定容。

渗透压调节液（17％氯化钠溶液）：取17g分析纯氯化钠，用三级水溶解并转移到100mL容量瓶中，定容。

7.3 试验步骤

7.3.1 发光细菌菌体复苏

从低温冰箱中取出装有青海弧菌Q67冻干粉的安瓿瓶置于室温15min平衡。用移液器吸取0.5mL复苏稀释液加入冻干粉安瓿瓶中，置于涡旋混合器上使之充分混匀、溶化，使青海弧菌Q67冻干粉完全溶解，形成乳白色均一液体。数分钟后在暗室观察应见绿色荧光。若无绿色荧光则不能使用，静置10min使其恢复发光性能备用。

7.3.2 预备实验

以10为公比做间隔开展预备试验，预备实验操作方法见7.3.3。根据预备试验结果选择正式试验合适的浓度范围，预备实验至少应设置5个浓度组，并以几何级数排布，公比应不大于2.2。

7.3.3 样品的发光值检测

按照预备试验结果，设定3～4个稀释度，最高和最低稀释度之间应包含预测所得的稀释浓度。每个浓度应设置3个平行样，同时设置空白对照的3个平行样。

取若干支2.5mL玻璃样品管，首先加入0.1mL渗透压调节液，之后分别向其中添加1.9mL不同浓度梯度的待测样品，另外吸取2mL复苏稀释液加入干净的样品管中作为空白对照。

向各样品管中依次加入50μL已复苏的冻干粉溶液，轻轻振荡，使之与试验样品充分混匀，轻敲玻璃管去除表层及样品管内壁附着的气泡。

放置15min后用发光细菌毒性检测仪测定样品和空白样品的发光值。

7.3.4 参比物苯酚溶液标准曲线的制作

每次检测样品时，用相同的发光细菌菌液同时制作苯酚标准曲线（如样品数量较多，可以用几支安瓿瓶打开后混合使用），试验操作方法与样品检测相同。

7.4 数据处理

按照公式（1）计算不同浓度下样品的相对发光强度值。

式中：

E——相对发光强度值（％）；

I——样品的发光值；

I0——空白样品的发光值。

绘制不同试验浓度对发光细菌相对发光强度值E的曲线，用Excel、SPSS等常用统计程序对曲线进行拟合。将E＝50％代入拟合公式，计算相对发光强度值为50％时的样品浓度，该浓度即为灭火剂样品对发光细菌的EC50值，并用标准方法计算95％的置信限，同时计算参比物质苯酚的EC50值。

7.5 质量控制

发光细菌急性毒性试验程序的质量控制要求应同时满足以下3点：

——空白对照组的发光值I0应大于106；

——平行样品之间的发光值偏差应小于20％；

——参比物质苯酚的EC50值应在100mg／L～200mg／L之间。